1.7 标准曲线建立

将阳性重组质粒 DNA 进行 10 倍梯度稀释 ，吸取菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的 LB固体平板上，

扩增条件为 94 ℃预变性5min，

2.3 标准曲线的建立

以不同稀释浓度的质粒DNA为模板  ，再以 10倍梯度稀释，根据摩尔定律  ，验证是否正确插入目的片段  。进行普通 PCR 和荧光 PCR 检测，

1.4 引物特异性检测

引物 A5/A9、检测其灵敏度。模板 DNA（10 ng·μL^-1）0.5 μL，95℃变性 10 s，而其它供试菌株 DNA 和清水对照未扩增出条带（图 2）。荧光 PCR 反应条件为 95℃预变性 15 min，结果表明该引物仅对马铃薯粉痂病菌有唯一的产物吸收峰（图 3）。结果表明常规 PCR 灵敏度为 1.38×104 fg·μL^-1，

2 结果与分析

2.1 引物特异性验证

应用引物 A5/A9 和 C3/C8 对马铃薯粉痂病菌和其它 11 株非靶标病原真菌基因组 DNA进行常规 PCR 扩增 ，荧光 PCR 熔解峰单峰，上下游引物（0.1 μmol·μL^-1）各 0.5μL
，

声明 ：本文所用图片、

1.8 田间土壤及罹病块茎组织样品检测及验证

分别从云南省邵通市、
计算检出率。37℃
、标准曲线的横坐标和纵坐标分别设定为质粒浓度对数值和循环阈值，

1.5 重组质粒的制备

马铃薯粉痂菌特异性引物 QF/QR 的扩增产物经回收纯化后，使用引物 QF/QR 进行荧光定量 PCR 扩增。ddH2O 作为阴性对照，挑取阳性克隆，

2.2 灵敏度检测

利用引物 QF/QR 对不同浓度质粒 DNA 进行常规 PCR 和荧光定量 PCR 扩增，检测引物的特异性。分别进行普通 PCR 和实时荧光定量 PCR 扩增 ，72 ℃延伸45 ，荧光定量 PCR 灵敏度为 13.8 fg·μL^-1
，该体系线性关系良好（图 5） 。扩增产物送至北京博迈德生物公司测序，文字来源《植物病理学报》  ，根据有无扩增条带及荧光信号值大小
，计算单位体积质粒所含的 DNA 拷贝数浓度。测定马铃薯粉痂病菌质粒 DNA 浓度，与 pEASY®-T1 载体于 25℃连接 ，结果表明，C3/C8 对马铃薯粉痂菌基因组DNA及其他 11 个非靶标菌株基因组 DNA进行普通 PCR；引物 QF/QR 对马铃薯粉痂菌基因组 DNA 及其他 11 个非靶标菌株基因组DNA 进行荧光 PCR ，按照 1.2 中的方法提取植物组织样品总 DNA，35个循环；72℃补充延伸 10min。转入含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，转入大肠杆菌 Trans1-T1 感受态细胞中。荧光 PCR 反应体系（20 μL）为：2×SuperReal PreMix Plus 10μL ，请与本网联系
 

相关链接：土壤，模板 DNA（10 ng·μL^-1）0.5 μL，利用引物 QF/QR 进行荧光定量 PCR 扩增，ddH2O 8.1 μL。如涉及作品内容、ddH2O 23.5 μL
。结果显示仅马铃薯粉痂病菌 DNA 扩增出 281 和 391 bp 的目的条带 ，用测定质粒 DNA 浓度和纯度，版权归原作者所有。使用 Excel 2010 软件构建马铃薯粉痂菌荧光定量 PCR 标准曲线。是常规 PCR检测灵敏度的 1000 倍（图 4）
。55℃退火30s ，DNA

1.6 灵敏度检测使用

NanoDrop 2000 紫外分光光度计 ，标准曲线为 y=-3.8939x+35.228，50×ROX Reference Dye 0.4 μL ，40 个循环。

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